顯微鏡中的二向色鏡主要用于對于不同波長光的分束。當(dāng)使用二向色鏡時，它不僅僅會影響光束的傳播方向，還會影響它的波前。我們制作濾光片的時候會鍍上薄膜來得到需要的過濾波段。涂層產(chǎn)生的應(yīng)力會導(dǎo)致基材的輕微彎曲或者曲率的不同。二向色鏡的彎曲對于反射的影響比透射大得多。對于透過二向色鏡的光束而言，彎曲僅僅會導(dǎo)致輕微的色散，導(dǎo)致光束有可以忽略的像差。這也就解釋了為什么傳統(tǒng)的熒光顯微鏡為什么不重視平整度這個參數(shù)，因為發(fā)射信號是透過二向色鏡的。二向色鏡的輕微彎曲雖然在傳統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)上不會造成很明顯的影響，但是會對更先進的顯微系統(tǒng)的成像造成不可忽視的負(fù)面影響。這也就促使著濾光片廠家研發(fā)出更加適合先進顯微系統(tǒng)的平整濾光片。

彎折或者彎曲的二向色鏡對于反射或者透射光束的光斑尺寸以及形狀

彎曲的二向色鏡對于反射的光束具有聚焦的作用

對于任意一束從45°方向被二向色鏡反射的光束而言，二向色鏡自身的曲率都會導(dǎo)致光束有一個附加的聚焦作用，同時導(dǎo)致焦平面位置的改變。而聚焦點的大小或者形狀也會發(fā)生改變。誠然我們可以通過改變探測器的位置來補償發(fā)射光束的焦平面位移，但是這會導(dǎo)致圖像質(zhì)量的損失。

光學(xué)器件的平整度可以通過每英寸器件對于633nm光的波分?jǐn)?shù)來標(biāo)示。二向色鏡的平整度的偏差主要是由于球面曲率的影響。球面曲率決定了二向色鏡反射光束的焦平面偏移。當(dāng)使用高斯光束的時候，聚焦的質(zhì)量由瑞利范圍判斷，瑞利范圍指的是指光束沿著其行進方向，從原始聚焦點到其面積為原始聚焦點面積兩倍的截面的距離，此時截面半徑約為1.414倍的聚焦點半徑。光束（或者一個成像點）在聚焦點的一個瑞利范圍內(nèi)仍然可以視為是聚焦的，這使其成為評判二向色鏡曲率的一個有效的指標(biāo)。如果聚焦點的偏移小于一個瑞利范圍，我們便可以忽略這個誤差。

如果二向色鏡存在彎曲，當(dāng)它以45°角反射時，產(chǎn)生的主要相差是散光，這會導(dǎo)致其在不同的方向（橫向和縱向）產(chǎn)生兩個不同的非對稱的焦點。雖然光束沒有完全的聚焦，但是我們可以在兩個焦點之間找到一個折中—即在圖像和更大焦斑之間成為模糊的中點中找到，這個點我們一般稱之為最小模糊圈。

由于二向色鏡的曲率導(dǎo)致反射產(chǎn)生兩種不同的焦點，中點是“最小模糊圈”

如果二向色鏡的曲率變大的話，散光的影響也會變小。以直徑為11 mm的光束為例，當(dāng)二向色鏡的曲率半徑大于150m的時候橫向和縱向的焦點就會非常相似。我們可以通過二向色鏡的曲率半徑（R）和成像透鏡的焦距（fTL）計算得到最小模糊圓的幾何尺寸半徑。對于非常大的曲率半徑而言，光束尺寸的增長只會引起很小的散光。

當(dāng)散光是相差的主導(dǎo)因素時，三階或者更高階的像差也會在聚焦或者成像的透鏡后面降低準(zhǔn)直光束的質(zhì)量。而二向色鏡更加平整的話，會有效的降低最小模糊圈的大小。

在TIRF中，二向色鏡反射照明和激發(fā)光束到達(dá)樣品，所以二向色鏡的平整度會對光束質(zhì)量產(chǎn)生影響。二向色鏡更加平整的話，可以提供在樣品表面更加均一的照明，降低背景噪音。如果TIRF的照明光束很小，比如直徑只有數(shù)毫米或者更小，二向色鏡的曲率半徑對于理想的聚焦光束的形狀和尺寸影響不大。而焦點的位置則不同，當(dāng)激光在TIRF顯微鏡上被二向色鏡反射的時候，光束必須被物鏡的背焦平面反射。彎曲的二向色鏡會改變焦平面，所以如果顯微鏡中對于激光準(zhǔn)直的調(diào)節(jié)不夠精確，這很難達(dá)到成功的TIRF激發(fā)。而TIRF技術(shù)是諸如PALM和STORM這樣的超分辨成像技術(shù)的基礎(chǔ)，所以以TIRF技術(shù)為基礎(chǔ)的種種超分辨成像技術(shù)都有對于高平整度二向色鏡的需求。下圖就是使用Semrock超平二向色鏡構(gòu)建的多波長STORM系統(tǒng)。

使用Semrock超平二向色鏡構(gòu)建的多波長STORM系統(tǒng)

不僅僅是TIRF顯微，對于具有寬波段以及激光激發(fā)的結(jié)構(gòu)照明顯微鏡，因為蒙板必須在激發(fā)光照射在樣品的光路上成像，所以對于焦平面位移的補償可能會帶來問題。如果二向色鏡的平整度不夠的話，由于照明成像光束的劣化，會導(dǎo)致網(wǎng)格無法在樣品表面成像，或者得到一個質(zhì)量足夠好的超分辨圖像。下圖就是中國科技大學(xué)的儲開芹老師使用Semrock超平濾光片構(gòu)建的SIM系統(tǒng)。

如果考慮實際的應(yīng)用，因為焦平面位移以及散光會因為光束尺寸的增加而增加，光束尺寸在確定我們需要的平整度時扮演了一個很重要的角色。某種濾光片或許對于使用較小光束的科研工作者是一個足夠平整的濾光片，但是對于另外的科研工作者而言，由于其使用的光束直徑較大，也許就不再適用。

采用Semrock超平濾光片的SIM系統(tǒng)

不同平坦度的二向色鏡的干涉儀條紋圖案（從左到右：3λ，1λ，λ/ 5 P-V RWE @ 633）。最終的平整度取決于涂膜應(yīng)力，基材不規(guī)則性和機械安裝應(yīng)力。

 

由于使用TIRF和超分辨顯微鏡，或者使用科研工作者自己開發(fā)的高性能顯微鏡系統(tǒng)都是有使用更大光束的趨勢，所以濾光片的平整度正在變得更加重要。Semrock全新改進的Brightline?二向色鏡為這些應(yīng)用提供了兩種業(yè)界優(yōu)秀的解決方案：在厚度為1mm或者3mm的基材上具有同樣的光譜表現(xiàn)。

Semrock可以提供裝配好的濾光片盒

在1mm厚的基材上，Semrock把激光二向色鏡經(jīng)過了重新設(shè)計，可以達(dá)到λ/2的PV平整度。這樣的平整度可以讓直徑為10mm的光束在反射的時候產(chǎn)生的偏移不超過一個瑞利范圍。超平的1mm厚二向色鏡可以使用在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡色塊里面，同時還簡化了在色塊與最小化的光束之間的透過轉(zhuǎn)換，這也就避免了在1mm與2mm的二向色鏡之間轉(zhuǎn)換的重新校準(zhǔn)的問題。

當(dāng)使用二向色鏡時，安裝的時候鏡片可能會遇到很大的壓力，從而降低了二向色鏡的平整度，因此安裝二向色鏡的時候需要保持好二向色鏡的平整度。在3mm厚的基材上，Semrock可以提供λ/10平整度的成品，這樣可以使22.5mm直徑的光束的偏移不超過1個瑞利范圍。這些3mm厚的二向色鏡是設(shè)計高質(zhì)量超分辨顯微鏡系統(tǒng)的科研工作者的首選，因為他們需要要用更大的光束來得到理想的圖像質(zhì)量。下表就是Semrock不同標(biāo)準(zhǔn)的二向色鏡。

參考文獻(xiàn)

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